熒光素酶報告基因?qū)嶒?/strong>是一種利用熒光素酶(Luciferase)與底物反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光，來檢測基因表達調(diào)控的靈敏技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因表達調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子活性、信號通路及藥物篩選等領(lǐng)域。
熒光素酶報告基因?qū)嶒?/strong>步驟：
質(zhì)粒構(gòu)建
靶啟動子插入：將感興趣的基因啟動子或調(diào)控元件(如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)克隆至熒光素酶表達載體(如pGL3-basic、pGL4系列)的上游。
內(nèi)參載體選擇：常用pRL系列載體(如pRL-CMV、pRL-TK)，啟動子活性需適中(如TK啟動子)，避免干擾主報告基因。
特殊載體：
pmirGLO：FLuc為主報告基因，RLuc為內(nèi)參，適用于miRNA研究。
psiCHECK：RLuc為主報告基因，F(xiàn)Luc為內(nèi)參，但酶切位點少，不適用于miRNA研究。
細胞轉(zhuǎn)染
細胞選擇：常用HEK293T、293細胞，也可根據(jù)實驗需求選擇其他細胞系。
轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣沉淀法、PEI、Lipofectamine 2000等。
質(zhì)粒比例：雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，內(nèi)參質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒比例約為1:10，確保內(nèi)參不影響主報告基因表達。
轉(zhuǎn)染時間：瞬時轉(zhuǎn)染后24-36小時檢測，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染需篩選單克隆。
細胞裂解與樣本處理
裂解液：使用PLB裂解液(Promega)裂解細胞，收集裂解液。
離心：12,000 rpm離心5分鐘，取上清用于檢測。
熒光檢測
儀器：發(fā)光檢測儀(Luminometer)或酶標儀(帶化學發(fā)光模塊)。
檢測順序：
加入FLuc底物(Luciferin + ATP)，檢測主報告基因熒光值。
加入RLuc底物(Coelenterazine + Stop緩沖液)，檢測內(nèi)參基因熒光值。
注意事項：
底物需避光保存，反應(yīng)時確保底物過量。
檢測時間控制在10秒內(nèi)，避免信號衰減。
樣品和試劑需平衡至室溫后再檢測。
數(shù)據(jù)分析
相對光強度(RLU)：計算主報告基因與內(nèi)參基因的熒光值比值。
歸一化處理：將實驗組RLU除以對照組平均RLU，得到相對活性。
結(jié)果展示：以柱狀圖展示對照組和實驗組的歸一化值。
關(guān)注公眾號