研究人員首先構(gòu)建了兩個(gè)分裂蛋白N65和66C，這兩個(gè)大小相當(dāng)?shù)牡鞍祝?/span>N65為10.3 kDa, 66C為13.5 kDa）在彼此靠近時(shí)會(huì)自發(fā)地發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，當(dāng)與底物furimazine（FMZ）孵育時(shí)，可以催化產(chǎn)生明亮穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)。例如，只有當(dāng)HEK細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染兩種結(jié)構(gòu)的分裂蛋白后，在細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中才能檢測(cè)出發(fā)光信號(hào)。然后研究人員利用這個(gè)工具來探究不同的細(xì)胞培養(yǎng)方式間蛋白質(zhì)的交換，包括直接共培養(yǎng)和間接培養(yǎng)。在直接培養(yǎng)模式中，無論是利用Hela細(xì)胞直接共培養(yǎng)體系還是人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和永生化人源星形膠質(zhì)細(xì)胞的直接共培養(yǎng)體系中均可以在細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中檢測(cè)到N65和66C兩者的蛋白轉(zhuǎn)移。此外，在人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和永生化人源星形膠質(zhì)細(xì)胞的間接共培養(yǎng)體系中，也可以在細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中檢測(cè)到明顯的發(fā)光信號(hào)。這些結(jié)果表明通過分裂的報(bào)告基因可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞通訊間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。

分裂報(bào)告基因構(gòu)建和功能蛋白轉(zhuǎn)移檢測(cè)

細(xì)胞通訊間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移很可能是通過胞外囊泡運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)，為了驗(yàn)證這一猜想，研究人員收集了高濃度的胞外囊泡，然后直接將胞外囊泡添加到轉(zhuǎn)染了N65或66C的HeLa細(xì)胞中，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中均可以檢測(cè)到發(fā)光信號(hào)。此外，為了進(jìn)一步證明該工具的多功能性，研究人員將核定位信號(hào)（nuclear localization signal, NLS）融合到N65結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)兩種NLS結(jié)構(gòu)的直接共培養(yǎng)沒有導(dǎo)致發(fā)光信號(hào)的顯著增加，NLS-N65與正常66C HEK細(xì)胞直接共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)光信號(hào)明顯增加。最后，研究人員還在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證了該工具的實(shí)用性。先將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染為帶有N65或66C結(jié)構(gòu)，然后在無胸腺裸鼠皮下注射MDAMB-231-N65或MDA-MB-231-66C細(xì)胞或兩者混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與只有一種細(xì)胞的對(duì)照組相比，在由兩種細(xì)胞組成的腫瘤中可以檢測(cè)到強(qiáng)烈的發(fā)光信號(hào)，且這種信號(hào)隨著時(shí)間的推移而增加。這也表明該工具可以用于研究體內(nèi)的細(xì)胞通信。

胞外囊泡介導(dǎo)的蛋白傳遞和體內(nèi)蛋白傳遞

綜上所述，研究人員開發(fā)了一種檢測(cè)蛋白質(zhì)直接、間接或胞外囊泡介導(dǎo)的通信功能傳遞的方法，展示了該方法在體內(nèi)和體外的功能性和適應(yīng)性。這一工具將有助于研究人員評(píng)估和改善細(xì)胞通信和功能性胞外囊泡介導(dǎo)的傳遞，并進(jìn)一步幫助我們理解體外和體內(nèi)的細(xì)胞通信。

參考文獻(xiàn)

1. Thomas S. S. et al. Illuminating cellular and extracellular vesicle-mediated communication via a split-Nanoluc reporter in vitro and in vivo. Cell Reports Methods 3, 2667-2375 (2023).

2. J. Zhao et al. Self-assembling NanoLuc luciferase fragments as probes for protein aggregation in living cells. ACS Chem. Biol. 11, 132-138 (2016).

3. B.A. Yang et al. Engineered tools to study intercellular communication. Adv. Sci. 8, 2002825 (2021).